流式间标法实验步骤

一、 样本准备

（收集细胞：根据你的样本类型（培养细胞、PBMC或全血）收集细胞）

1：培养细胞/PBMC：收集细胞悬液，计数，在进行间接标记法流式检测时，推荐细胞活力 > 95%，最低一般不应低于 90%。

     全血样本：通常使用EDTA抗凝全血。如果目标细胞群是淋巴细胞等单个核细胞，可先通过密度梯度离心法分离PBMC；如果后续使用溶血素处理，也可直接使用全血进行染色。

2：洗涤细胞：用冰冷的PBS（含1% BSA或FBS）洗涤细胞一次，以去除培养基或血浆成分。离心条件通常为 300-400g，离心5分钟。

3：调整浓度：弃上清后，用含 10% FBS（或1% BSA）和 0.1% 叠氮化钠的冰冷PBS重悬细胞，将细胞浓度调整为 1-5 x 10⁶ 细胞/mL。

 ★注意：叠氮化钠可以抑制表面抗原的调变和内化，低温操作同理。

二、染色步骤（这是实验的核心环节，需严格控制孵育温度和洗涤质量）

1：加一抗：

    取 100 μL 上述细胞悬液（即含有 1-5 x 10⁵ 个细胞）加入到流式上样管或离心管中。加入适量一抗（参考说明书推荐浓度，可用PBS稀释），轻轻混匀。

    孵育条件：通常在 4℃ 避光孵育 30分钟或室温避光孵育 15分钟。对于一些敏感性抗原，建议4℃孵育以维持细胞活性和抗原稳定性。如果是全血快速法，室温孵育较常见。

2：洗涤（关键步骤）：

     加入 1-2 mL 冰冷的PBS（含1% BSA）缓冲液。离心（300-400g，5分钟），弃上清。尽量吸干残留液体，但避免吸到细胞沉淀。重复洗涤2-3次。目的是彻底洗去未结合的一抗，降低背景。

3：加二抗：

   根据一抗的宿主来源（如小鼠IgG），选择合适的荧光素标记的二抗（如羊抗小鼠IgG（AWS0003 ，AWS0004））。用含3% BSA的PBS将二抗稀释至最佳工作浓度（参考说明书），加入到细胞沉淀中，重悬细胞，轻轻混匀。

    孵育二抗：通常在 4℃ 避光孵育 30分钟或室温避光孵育 15分钟。

 （关键：从此步开始到上机检测前，细胞务必避光，以防止荧光淬灭。）

4：洗涤（关键步骤）：

   加入 1-2 mL 冰冷的PBS（含1% BSA），离心（300-400g，5分钟），弃上清。重复洗涤2-3次。此次洗涤是为了去除未结合的游离二抗，减少非特异性荧光。

5：重悬：

     加入 100μL 的PBS（含1% BSA或固定液）重悬细胞，准备上机检测。

三、 注意事项

1：固定（如不能立即上机）：

    如果染色完成后不能立即上机检测，或者需要灭活样本中的生物危害性，可以进行固定。用 1-2% 多聚甲醛（PFA） 重悬细胞，4℃避光保存。固定后的样本通常建议在24小时内检测，且可能影响某些荧光染料的亮度。

  间标法由于引入了二抗，背景可能高于直标法，以下措施可以帮助优化结果：

2：设置对照：

    必须设置同型对照（使用与一抗同源型的非特异性抗体代替一抗）及空白对照（不加一抗，只加二抗），以评估二抗的非特异性结合。

3：封闭Fc受体：

     对于表达Fc受体的细胞（如巨噬细胞、B细胞），在加一抗前，先用 5-10% 来自二抗宿主动物的正常血清或CD16/32抗体（Fc Block）（AWA06009）进行封闭，孵育条件与一抗相同，此步可有效减少抗体的非特异性结合。

4：使用F(ab')₂片段：

    可以考虑使用F(ab')₂的荧光二抗，因为它们缺少Fc段，不会与细胞的Fc受体结合。

                                                                          细胞免疫荧光步骤

1) 取出爬片/涂片， PBS清洗2~3次；

2)固定： 将爬片用4%多聚甲醛（AWI0056） 固定30min；

3)洗涤： PBS冲洗5 min x 3次；

4) 通透：加入用PBS稀释的0.2%-0.5% Triton X-100（AWI0603），室温静置5-15min，在细胞膜上打孔，便于抗体进入细胞内与抗原结合。PBS冲洗3 min x 3次；

  （注意：如果检测的目标抗原仅位于细胞膜表面，此步可省略）

5) 封闭：加入含5% BSA或与二抗同源血清（AWI0115）的封闭液，室温孵育30-60min，以封闭非特异性结合位点，降低背景染色。

   （操作提示：此步结束后，通常吸去封闭液即可，不用洗涤）

6) 孵育一抗：滴加适当稀释的一抗（例如SIRT3；AWA10553），确保完全覆盖细胞。置于湿盒中，4℃孵育过夜或37℃孵育1-2h。（ 4℃过夜通常有助于获得更高的特异性）。PBS冲洗5 min x 3次；

7) 孵育二抗：滴加50~100ul抗-Rabbit-IgG标记荧光抗体（Goat anti-Rabbit IgG (H+L) Secondary Antibody, Alexa Fluor 488；AWS0003），37℃孵育90 min，PBS冲洗5 min x 3次；

 （注意：从此步开始，直至实验结束，所有操作均需严格避光，防止荧光淬灭）

8) 染核：DAPI工作液（AWC0293）37℃染核10 min，以标记细胞核位置，便于镜下寻找细胞和观察细胞形态。 PBS冲洗5 min x 3次；

9)封片：在洁净载玻片上滴加一小滴抗荧光淬灭封片剂（AWI0197）。用镊子小心取出细胞爬片，吸去边缘多余液体，将有细胞的一面朝下，缓慢盖在封片剂上，避免产生气泡。可用透明指甲油涂抹盖玻片边缘进行固定和密封。

10) 观察拍照：到荧光显微镜下观察或避光保存。

Western Blot 实验步骤

原理：蛋白质印迹法（免疫印迹试验）即Western Blot。它是分子生物学、生物化学和免疫遗传学中常用的一种实验方法。其基本原理是经过PAGE(聚丙烯酰胺凝胶电泳)分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜NC膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。

流程图：

蛋白提取 → 浓度测定 → 电泳 → 转膜 → 封闭 → 一抗二抗孵育 → 曝光

一、蛋白提取（以细胞样品为例）

1. 用冰预冷PBS洗涤细胞一次，加入200 uL RIPA裂解液（AWB0136），用细胞刮刀刮下细胞，收集悬液，超声破碎1.5min。

2. 冰上，裂解10min；

3. 4℃，12000 rpm离心 15 min。（提前开离心机预冷）

4. 将离心后的上清转移倒 1.5mL的离心管中备用；

二、蛋白浓度测定

按照BCA蛋白定量试剂盒（AWB0104）使用说明操作，测定蛋白浓度。

1. 配制BCA工作液：根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B（50：1）配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24h内稳定。

2. 配制标准品：标准品用RIPA裂解液（或者和待测样品一致的稀释液）按照50%梯度稀释。

3. 按照BCA蛋白定量试剂盒操作步骤进行到测定，并根据标准曲线计算出待测样品的蛋白浓度

三、电泳

    1. 根据目的蛋白分子量(MW）配制SDS-PAGE胶(AWB0057)备用。

    2. 在EP管中制备样品。按照蛋白样品和蛋白上样缓冲液（AWB0055）按4:1混合，沸水煮5min，以充分变性蛋白，放入冰盒中速冷备用。

    3.上样：左边第一孔加入蛋白marker（AWB0236） 2 uL，其它每孔上样10-20 uL。以蛋白定量结果为准，使每个孔总蛋白质量统一为20~40ug。

    4. 加入到1X电泳缓冲液（AWB0085）中，开始电泳，电泳恒定电压80V，直至蛋白质迁移出浓缩胶区域， 再将电压调至 140V，继续电泳直至溴酚蓝迁移到分离胶底部 0.5cm处，关闭电源。

四、转膜

1. 按照分子量分别切胶，并裁剪好转膜用的滤纸和NC膜，浸泡在1X转膜缓冲液中（AWB0207）

2. 按照3张滤纸+NC膜+胶+另3张滤纸的顺序依次放好，要求中间没有气泡。

3. 盖上仪器，接通电源，300 mA恒定电流转膜，根据蛋白分子量大小确定转膜时间，比如内参actin，42kDa 转膜60min。

4. 转膜完毕后，将膜取出放入1*TBST（ AWB0191）中洗1次。

五、封闭

     将膜取出后，浸入Western封闭液（ AWB0214）中，摇床上室温摇晃封闭60min。

六、一抗二抗孵育

    1. 根据抗体推荐稀释比例，用抗体稀释液（AWB0199）稀释一抗，将膜与一抗一起孵育，4℃过夜

    2. 第二天，取出，室温恢复30min。

    3.  1*TBST洗3次，每次10min。

    4.  用1*TBST稀释HRP标记的二抗 ，将稀释后的二抗与膜共同室温孵育90min。

    5. 孵育结束，1*TBST洗3次，每次15min。

七、显色曝光

    1. 配制ECL发光液工作液：根据ELC发光液试剂盒（ AWB0005）操作说明配制工作液

    2. ECL显色曝光：使用ECL化学发光液与膜充分反应，用滤纸吸尽多余液体，用塑封膜将膜包裹杂交膜，凝胶成像系统成像。

IHC-P（石蜡切片免疫组化）步骤

一、脱蜡

1) 切片脱蜡至水：先将切片置于二甲苯中20 min，3次。然后依次在100%，95%，85%和75%乙醇浸泡，每次浸泡5 min。再用蒸馏水浸洗5 min 1次；

  (注意：脱蜡必须彻底，否则会影响抗体结合；整个水化过程中，务必保持切片湿润，切勿干燥，否则会产生严重的非特异性背景染色。)

二、抗原修复

2) 热修复抗原：将切片浸入柠檬酸修钠抗原修复液中（AWI0206）, 微波炉加热至沸腾后断电，低火煮20min后，冷却20min后拿出，继续冷却至室温。冷却后0.01M PBS（pH7.2~7.6）洗涤3 min x 3次；

  (注意：由于固定过程会掩盖抗原，需要通过加热（如微波修复、高压修复）或酶解（如胰蛋白酶）的方法暴露抗原决定簇。常用的修复液包括pH 6.0的柠檬酸钠抗原修复液和pH 9.0的EDTA（AWI0152）缓冲液。）

3) 阻断内源性酶：将切片放入3%双氧水，室温浸泡10 min以灭活内源性酶，防止内源性酶和后续的检测系统发生非特异性反应。PBS冲洗3 min x 3次；

三、免疫组织化学染色

4) 封闭：取出片子，甩干，擦净水分，滴加与二抗同源的血清（如山羊血清），室温孵育10-30min，封闭组织中带电荷的基团，以减少抗体的非特异性结合。

5) 孵育一抗：吸水纸吸去多余液体（此时注意不要干片），滴加适量稀释（通用型抗体稀释液：AWT0199）后的一抗，室温湿盒孵育1h或者4℃过夜。

6) PBS冲洗5 min x 3次；

7) 孵育二抗：甩干，擦净水分，滴加适量（50ul~100ul）HRP标记的二抗（AWI0722，AWI0723）37℃孵育30 min，PBS冲洗5 min x 3次；

8) DAB显色：甩干，擦净，滴加预制好的显色剂DAB（AWB0175）工作液50~100 μL，室温孵育0.5~5 min， 镜下观察控制反应时间直至显色至预期深浅。（DAB工作液现配现用）

9) 甩干，擦净，蒸馏水洗涤3次，1min/次；

10) 复染：苏木素（AWI0009）复染5~10 min，蒸馏水冲洗，PBS返蓝；使细胞核呈现蓝色，以便于观察目标蛋白的定位（胞核、胞浆或胞膜）。

11) 脱水，透明：各级酒精（70%，80%，95%，100%）脱水，每级浸泡5 min。取出后置于二甲苯透明10 min，2次

12) 从二甲苯中取出切片，中性树胶封片、显微镜观察。