荧光单标信号放大试剂(TSA-570)

产品介绍

酪酰胺信号放大技术（Tyramide Signal Amplification, TSA）主要是利用酪胺的过氧化物酶反应。酪胺非活性荧光素底物在HRP和过氧化氢的作用下，会被激活产生活化荧光底物，同时形成共价键结合位点，共价结合在蛋白抗原表面或附近的酪氨酸残基上，抗原和抗体的结合部位就会有大量的酪胺荧光素沉积，使抗原位点处的荧光信号增强。

酪胺荧光素底物-抗原酪氨酸共价稳定结合，故TSA信号不会受微波影响，可用热修复法清除第一轮与抗原非共价结合的抗体复合物(冰冻切片，细胞爬片样本请试用抗体洗脱液洗脱法清除)，并能在抗体去除后保留与抗原相关的荧光信号。然后，再用第二种一抗进行第二轮孵育，同时更换另一种酪胺荧光素底物，多次循环反复，不同的酪胺荧光素进行标记就可实现多重免疫组化染色。

TSA原理示意图

产品组成成分

保存条件

1、荧光染料（TSA-480/520/570/620/690/780）： -20℃避光保存，12个月

2、内源性过氧化物酶阻断剂、超敏酶标山羊抗小鼠/兔 IgG 聚合物 ：4℃避光保存，有效期 12 个月。

3、抗体洗脱液 ：RT保存，有效期 12 个月。

实验前材料准备

  1、石蜡或冰冻切片，细胞爬片。建议配合 Abiowell 带有 IF-T 应用的一抗使用。

    石蜡切片：建议一抗应用中注明 IHC-P/IF-T；

    冰冻切片：建议一抗应用中注明 IHC-F/IF-T；

    细胞爬片：建议一抗应用中注明 IF/ICC/IF-C；

  2、缓冲液与修复液：PBS 缓冲液（货号：AWC0215）、柠檬酸钠抗原修复液（货号：AWI0206）（或其他适配修复液）。

  3、DAPI 染色液（推荐浓度：5μg/mL 货号：AWC0293）

  4、其他辅助材料：组化笔、避光湿盒、慢速摇床、抗荧光淬灭封片剂（货号：AWI0197）等。

  5、封闭山羊血清（货号：AWI0115）

操作步骤

（一）操作前注意事项

1、TSA 染色灵敏度高于常规的荧光显色，建议开展正式实验前，进行单色预实验，选择最适合的一抗稀释比例；

2、在进行多重染色时，通常建议先标记预实验中阳性丰度低的抗体。

3、针对四标染色，推荐的染色顺序为：TSA-520 → TSA-570 → TSA-690 → TSA-620。

4、由于 TSA-570 与 TSA-620 染料的发射波长较为接近，使用宽带通成像设备易出现信号串色，若需同时使用，需注意：

*建议将 TSA-570 与 TSA-620 搭配弱阳性一抗使用；

*尽量避免将其用于同一细胞中共同表达的靶标（例如 CD3 与 CD4 的共染组合）；

*图像采集时，请务必使用配备窄带通滤光片的成像设备，以有效区分相邻通道信号，确保成像质量。

5、加入荧光染料及后续步骤需进行避光操作。

6、操作过程中需保持载玻片组织的湿润，如出现干片情况，会导致非特异性的染色结果。

7、持续加热修复的过程中，只需中小火维持沸腾，切勿高火加热让容器内试剂蒸发导致干片，且高火易导致组织脱片。

8、使用小鼠组织实验时，建议选用兔源一抗搭配 HRP 标记的抗兔二抗，可减少非特异性染色。

9、对富含脂肪的组织（如肝脏、乳腺等）染色时，建议在第 11 步 DAPI 染色前增加苏丹黑处理步骤，可有效消除脂肪的自发荧光及非特异性着色，避免干扰目标抗原信号检测，提升目标信号清晰度与检测准确性。

（二）石蜡切片操作步骤（四标为例）

1、脱蜡复水：

(1)将石蜡玻片在 60 ℃ 烘烤 1-2 小时。

(2)依次将切片放入二甲苯Ⅰ 15 分钟→二甲苯Ⅱ 15 分钟→二甲苯Ⅱ 15 分钟→无水乙醇Ⅰ 10分钟→无水乙醇Ⅱ 10分钟→ 95% 乙醇 5 分钟→ 85% 乙醇 5 分钟→ 75% 乙醇 5 分钟→蒸馏水洗。

2、抗原修复：

(1)向容器中加入约 2/3 体积的柠檬酸修复液或 EDTA 修复液，加盖后用微波炉高火加热至沸腾（修复液及条件需根据组织、抗原类型调整）；

(2)取出容器，待液体停止沸腾后，将切片间隔插入切片架并放入容器；

(3)容器放回微波炉，低火加热 20 分钟，加热结束后在微波炉内静置 20 分钟后，取出自然冷却；

(4)将玻片转移至 PH7.4 的 PBS 中，用慢速摇床洗涤 3 次，每次 5 分钟；

(5)擦干组织周围水分（保持组织湿润），用组化笔在组织周围画封闭圈。

3、内源性过氧化物酶阻断：

向组织滴加内源性过氧化物酶阻断剂，在湿盒内室温孵育 10-15 分钟；随后将切片放入 PBS中，用慢速摇床洗涤 3 次，每次 3 分钟。

4、封闭：

   用正常山羊血清均匀覆盖组织，室温封闭30min。

5、一抗孵育：

沥干玻片（约几秒），稀释一抗后滴加至完全覆盖组织；室温或 37 ℃ 孵育 3-4 小时，或 4 ℃ 湿盒过夜后 37 ℃ 复温 1-2 小时；最后用 PBST 冲洗 3 次，每次 2分钟。

6、二抗孵育：

沥干玻片，滴加 50-100μL 超敏酶标山羊抗小鼠/兔 IgG聚合物（以覆盖组织为宜），室温孵育 30 分钟；用 PBST 冲洗 3 次，每次 2 分钟。

7、TSA 反应：

再次沥干玻片，滴加 50-100μL TSA-520 荧光染料（覆盖组织即可），孵育 5-15 分钟；PBST冲洗 3 次，每次 2分钟。

8、抗体洗脱：

将切片间隔插入切片架，放入含煮沸修复液的容器（煮沸修复液需能没过组织）；微波炉低火加热 20 分钟后，在微波炉内静置 20 分钟，取出自然冷却；将玻片转移至 PH7.4 的 PBS 中，慢速摇床洗涤 3 次，每次 5 分钟。

9、第二轮染色：

重复步骤 4-8，一抗更换为第二种目标一抗，TSA荧光染料换为 TSA-570。

10、第三轮染色：

重复步骤 4-8，一抗更换为第三种目标一抗，TSA荧光染料换为 TSA-690。

11、第四轮染色：

重复步骤 4-7（无需抗体洗脱），一抗更换为第四种目标一抗，TSA荧光染料换为 TSA-620。

（注：多重免疫荧光染色的最后一轮均无需抗体洗脱）

12、DAPI 复染细胞核：

将玻片放入 PH7.4 的 PBS 中，慢速摇床洗涤 3 次，每次 5分钟；稍甩干后，向封闭圈内滴加DAPI 染液，避光室温孵育 10 分钟。

13、封片：

PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟；稍甩干切片，用抗荧光淬灭封片剂封片。

14、镜检拍照：

在荧光显微镜、共聚焦显微镜、多通道荧光扫描仪或多光谱成像系统下观察并采集图像。

（三）细胞爬片/冰冻切片使用步骤（四标为例）

1、固定（选做）：

冰冻切片：复温至室温后，滴加 4% 多聚甲醛（试剂盒未提供）孵育 10-15 分钟，室温晾干后用 PBS 浸泡脱胶（3 缸，每缸 10 分钟）；若 OCT 包埋前未固定，建议必做此步骤。

细胞爬片：直接加入 4% 多聚甲醛固定 10-15 分钟，PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。

2、破膜（选做）：

用 0.1-0.3% Triton X-100（需自备，浓度不建议超过 0.3%）室温通透 20 分钟；免疫原在胞外段的一抗可省略此步骤；后续用 PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟。

3、内源性过氧化物酶阻断：

(1)擦干组织周围水分（保持组织湿润），用组化笔在组织周围画封闭圈。

(2)向组织滴加内源性过氧化物酶阻断剂，在湿盒内室温孵育 10-15 分钟；随后将切片放入PBS中，用慢速摇床洗涤 3 次，每次 3 分钟。

4、封闭：

 用正常山羊血清均匀覆盖组织，室温封闭30min。

5、一抗孵育：

沥干玻片（约几秒），稀释一抗后滴加至完全覆盖组织；室温或 37 ℃ 孵育 3-4 小时，或 4 ℃ 湿盒过夜后 37 ℃ 复温 1-2 小时；最后用 PBST 冲洗 3 次，每次 2 分钟。

6、二抗孵育：

沥干玻片，滴加 50-100μL 超敏酶标山羊抗小鼠/兔 IgG聚合物（以覆盖组织为宜），室温孵育 30 分钟；用 PBST 冲洗 3 次，每次 2 分钟。

7、TSA 反应：

滴加 50-100μL TSA-520 荧光染料（覆盖组织即可），孵育 5-15 分钟 PBST 冲洗 3 次，每次 2 分钟。

8、抗体洗脱：

滴加适量 37 ℃ 预热的抗体洗脱液覆盖组织，37 ℃ 放置 5-20 分钟，甩干后无需洗涤，再次滴加适量抗体洗脱液覆盖组织 37 ℃ 放置 5-20 分钟(通常两次洗脱合计20分钟），PBST 洗三次，每次 5 分钟。

9、第二轮染色：

重复步骤 4-8，一抗更换为第二种目标一抗，TSA荧光染料换为 TSA-570。

10、第三轮染色：

重复步骤 4-8，一抗更换为第三种目标一抗，TSA荧光染料换为 TSA-690。

11、第四轮染色：

重复步骤 4-7（无需抗体洗脱），一抗更换为第四种目标一抗，TSA荧光染料换为 TSA-620。

（注：多重免疫荧光染色的最后一轮均无需抗体洗脱）

12、DAPI 复染细胞核：

将玻片放入 PH7.4 的 PBS 中，慢速摇床洗涤 3 次，每次 5分钟；稍甩干后，向封闭圈内滴加 DAPI 染液，避光室温孵育 10 分钟。

13、封片：

PBS 洗涤 3 次，每次 5 分钟；稍甩干切片，用抗荧光淬灭封片剂封片。

14、镜检拍照：

在荧光显微镜、共聚焦显微镜、多通道荧光扫描仪或多光谱成像系统下观察并采集图像。

荧光染料参数表：

常见问题

 1、染色过深：一抗浓度过高，时间过长；TSA孵育时间过长，导致非特异性结合。

2、染色过浅或无染色：一抗浓度过低，时间过短；抗原修复不够；HRP是否失效。

3、无特异性染色：切片脱蜡不彻底。可适当延长烤片时间。

4、有明显串色现象：上一支一抗未洗脱干净。

5、抗体洗脱液使用三轮及以上易致组织 / 细胞核损伤，为降低核破碎风险，前两轮染色后的一抗洗脱可采用以下方法：将切片间隔置于切片架，浸入 50-60 ℃热水中浸泡 5-20 分钟，重复 2-3 次；若一抗残留未净，可少量使用抗体洗脱液并缩短孵育时长。第三轮开始使用抗体洗脱液正常洗脱。

注意事项

1、试剂初次使用前请置于4℃解冻，解冻后于4℃短期保存，避免反复冻融，请尽快使用。

2、为了您的安全和健康，请穿好实验服并佩戴一次性手套和口罩操作。

    3、本产品仅限于专业人员的科学研究用，不得用于临床诊断或治疗，不得用于食品或药品。

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